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Agatha
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Live Cell Imaging

Post by Agatha » 29.03.2013, 09:21

Ausarbeitung zum Vortrag 'Live Cell Imaging', Vortrag und Beispielvideo.


Live Cell Imaging
Ausarbeitung für das Seminar Cell Visualization (SS '12) von Agatha Walla

Bevor das Live Cell Imaging etabliert wurde, gaben die Analyse fixierter Zellen und biochemische
Studien Aufschluss über grundlegende Prinzipien in der Zellbiologie. Um molekulare und zelluläre
physiologische Abläufe erkennen zu können, waren diese Methoden nicht hinreichend. Der Grund
hierfür ist die Dynamik in Zellen, deren Komponenten nicht steif sind, denn erst die Organisation
und Dynamik von Makromolekülen gibt Aufschluss über ihre Funktion. Geeignete Methoden für
diese Problematik bietet das Live Cell Imaging.
Der revolutionierende Schritt zur Etablierung der Methoden des Live Cell Imaging war die
Entdeckung und Optimierung von fluoreszierenden Proteinen und die fortschreitende Entwicklung
der Mikroskopie. Fluoreszenzproteine bieten die Möglichkeit mit anderen Proteinen Gen-
spezisifisch fusioniert zu werden und damit die räumliche und zeitliche Veränderung des
untersuchten Proteins aufzuklären.

Abbildung 1: Design eines Genkonstrukts zur Proteinlokalisation. Die Gensequenz des zu
untersuchenden Proteins wird gefolgt von der Gensequenz eines Reporterproteins (hier GFP). Das
Stoppcodon des untersuchten Proteins muss hierbei entfernt werden, sodass GFP direkt an das
Protein gekoppelt wird. Zur Induktion der Expression dieses Konstruktes wird ein Promotor
benötigt.

Ein großes Problem bei der Benutzung von Fluoreszenzproteinen ist die Eigenfluoreszenz der
Zellen, die sogenannte 'Autofluoreszenz' oder 'Primärfluoreszenz'. Dieses Phänomen stört vor allem
die Betrachtung von Pflanzenzellen, die eine starke rote Autofluoreszenz des Chlorophylls aufweisen.
Chlorophyll ist aus einem Porphyrin Ring mit zahlreichen Doppelbindungen aufgebaut und zeigt bei
Anregung mit grünem Licht eine starke rote Fluoreszenz. Um diesem Hintergrundsignal zu
entgehen werden Fluoreszenzproteine des Live Cell Imaging optimiert und deren Anregungsbereich
verringert (Abb. 2).

Abbildung 2: Palette von fluoreszierenden Proteinen unterschiedlicher Farben, die entweder aus GFP oder RFP (red fluorescent protein) entwickelt wurden.

Das Einbringen von bestimmten Fluorophoren über Genfusionen kann Aufschluss über die
Proteinlokalisation, die Interaktion zwischen zwei Proteinen und die Diffusion innerhalb der Zelle
des Proteins geben:
• Eine Interaktion von zwei Proteinen wird häufig durch eine FRET (Förster Resonance Energy
Transfer) Messung ermittelt. Hierbei wird ein Protein mit einem Donor-Fluorophor gekoppelt,
das andere mit einem Akzeptor-Fluorophor. Das besondere an beiden Fluorophoren ist, dass
der Donor bei einer Wellenlänge angeregt wird, die keine Auswirkung auf den Akzeptor hat.
Die Emission des Donors entspricht aber wiederum dem Anregungsbereich des Akzeptors, der
durch diesen Energietransfer ein Signal geben kann (Abbildung 3A). Das Signal einer FRET
Messung ist sehr spezifisch, da der Energietransfer erst ab einer räumlichen Distanz von 10 nm
und weniger stattfinden kann und damit für eine tatsächliche Interaktion der gekoppelten
Proteine spricht.
• Die Bewegung von Molekülen innerhalb einer Zelle aufzuklären, ist eine der bedeutendsten
Aufgaben des Live Cell Imaging. Hierfür werden photoinduzierbare Fluorophore genutzt, wie z.B. Dronpa. Mit Dronpa ist es möglich, reversibles Photoswitching anzuwenden. Dronpa wird
bei einer Wellenlänge von 405 nm aktiviert, also detektierbar, und mittels einer Wellenlänge
von 488 nm wieder deaktiviert. Die Induzierbarkeit wird häufig genutzt für 2 verschiedene
Ansätze zur Untersuchung der Diffusion von Proteinen: FRAP (Fluorescence Recovery after
Photobleaching) und FLIP (Fluorescence Loss in Photobleaching). Bei FRAP Messungen liegt
die gesamte Zelle photoaktiviert vor. Es wird ein Teil der Zelle ausgewählt (z.B. in einem
bestimmten Kompartiment), welcher mittels eines genauen kurzen Lichtstrahls einer
Wellenlänge von 488 nm ausgeschaltet wird. Daraufhin wird in zeitlichem Abstand verfolgt,
wie die ausgeschaltete Bereich von dem umliegenden Protein mit aktivierten Dronpa wieder
gefüllt wird. Dies ermöglicht eine einfach Berechnung der Diffusionsgeschwindigkeit des
Proteins von Interesse. Eine FLIP Messung beruht auf einem ähnlichen Prinzip wie die FRAP
Messung. Zunächst wird die untersuchte Zelle einem Prebleach unterzogen, das bedeutet einer
ganzheitlichen Aktivierung von Dronpa mit Licht einer Wellenlänge von 405 nm. Nach dem
Prebleach wir ein bestimmter Bereich der Zelle kontinuierlich mit Licht einer Wellenlänge von
488 nm bestrahlt. Dies hat zur Folge, dass in diesem Bereich Dronpa vollständig deaktiviert
wird. Um Aufschluss über die Diffusionsgeschwindigkeit des Proteins von Interesse zu
gewinnen, wird das Fluoreszenzsignal in der gesamten Zelle über die Zeit betrachtet. Durch die
Diffusion verliert die Gesamtheit der Zelle an aktivierten Fluoreszenzprotein, das in einem
Punkt durchgehend deaktiviert wird. Gemessen über die Zeit lässt sich wiederum die
Diffusionsgeschwindigkeit berechnen. Spezifischer lässt sich sogar die Diffusion aus einem
bestimmten Kompartiment in der Zelle bestimmen, indem dieses Kompartiment speziell
Dronpa-deaktiviert wird.

Abbildung 3: Nachweis von Proteininteraktion und -diffusion durch Live Cell Imaging Methoden.
(A) Prinzip der FRET-Messung. (B) Reversibles Photoswitching von Dronpa.

Die aufgezählten Methoden des Live Cell Imaging stellen jedoch nicht die gesamte Bandbreite der
Techniken in diesem Gebiet dar. Durch die fortschreitende Forschung und Entwicklung verbesserter
Mikroskopietechniken wird die Betrachtung von Zellen in vivo mit ihrer Dynamik zur
grundlegenden Charakterisierung.

Quellen:
Stephens & Allan, „Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging“, 2003, Science 300
(5616): 82-86
Sekar & Periasamy, „Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of
live cell protein localizations“, 2003, JCB vol. 160 no. 5 629-633
Hofkens et al., „Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein
Dronpa“, 2005, PNAS vol. 102 no. 27 9511-9516
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