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Raphael
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Joined: 27.04.2014, 17:52

Special Microscopy Techniques [DEUTSCH]

Post by Raphael » 16.10.2014, 12:57

Special Microscopy Techniques:
Elektronenmikroskopie (engl. electron microscopy) und Gefrierbruch/Gefrierätzung (engl. freeze-fracture technique)


Im Jahr 1665 entdeckte Robert Hook zwar schon die Zelle, „aber Landkarten von ihrer inneren Geographie gibt es eigentlich erst seit wenigen Jahrzehnten. Die meisten Strukturen in ihrem Inneren, auch Organellen genannt, sind zu klein, um im Lichtmikroskop optisch aufgelöst zu werden.“* Die Zellbiologie konnte in den 50er Jahren schnelle Fortschritte machen, als das Elektronenmikroskop aufkam.

*//Neil A. CAMPELL / Jane B. REECE / Jürgen MARKL (Hrsg.): Biologie, 6. Aufl., München 2006, S. 131.

Bei der Elektronenmikroskopie handelt es sich um ein Vergrößerungssystem, das Elektronenstrahlen anstatt Licht nutzt und im Vakuum durch mehrere magnetische Linsen fokussiert. An die Stelle von Glaslinsen (wie beim Lichtmikroskop) treten Elektromagneten. „Seine Auflösung liegt mehr als 100-mal höher als das der besten Lichtmikroskope.“* Prinzipiell lassen sich die Arten der Elektronenmikroskope in zwei Hauptgruppen einteilen. Zum einen das Transmissionselektronenmikroskop (TEM) und zum anderen das Rasterelektronenmikroskop (REM). Zwar gibt es eine Vielzahl besonderer Arten von Elektronenmikroskopen, allerdings soll im Folgenden der Schwerpunkt auf das TEM und das REM gelegt werden.

*//Oswald ROTTMANN, Paul HÖFER: Lexikon Biologie. Fachbegriffe der Biologie, Freising 2002, S. 58.



Das Transmissionselektronenmikroskop (TEM)
Elektronenmikroskop.jpg
Elektronenmikroskop.jpg (65.14 KiB) Viewed 14106 times
(Abb.2 Transmissionselektronenmikroskop)*

*//Quelle: Elektronenmikroskop bei Wikimedia commons. (http://commons.wikimedia.org/wiki/File: ... roskop.jpg)
Urheber: Stahlkocher (http://commons.wikimedia.org/wiki/User:Stahlkocher)
Lizenz: Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 unported
(http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.en


Das TEM hat den Vorteil gegenüber dem Lichtmikroskop, dass es eine höhere Auflösung und dementsprechend eine deutliche Vergrößerung von Objekten schafft. Allerdings hat es den Nachteil, dass es noch nicht möglich ist, lebende Objekte zu betrachten, weshalb die jeweiligen Proben zur Untersuchung erst präpariert werden müssen. Dies wird entweder durch Einfrieren oder durch chemische Bearbeitung der Probe gewährleistet. Das TEM, das vorwiegend in der Biologie zur Untersuchung der inneren Ultrastruktur von Zellen dient, schickt, wie oben schon angedeutet, einen Elektronenstrahl durch einen Dünnschnitt des Objekts, ganz ähnlich wie das Licht in einem Lichtmikroskop. Glaslinsen sind jedoch für Elektronen undurchlässig, weshalb man im TEM Elektromagnete verwendet, die den Weg der geladenen Elektronen beugen. Zuletzt fällt das Bild auf einen Schirm, wo es betrachtet, fotografiert oder digital abgespeichert werden kann. Um den Bildkontrast zu verstärken, färbt man sehr dünne Schnitte der fixierten Zelle mit Schwermetallatomen, die sich an bestimmten Stellen der Zelle anheften.


Das Rasterelektronenmikroskop (REM)
JEOL_JSM-6340F.jpg
JEOL_JSM-6340F.jpg (607.24 KiB) Viewed 14106 times
(Abb.4 Rasterelektronenmikroskop)*

Das REM eignet sich besonders zur genauen Untersuchung der Oberfläche von Objekten (vgl. Abb. 5). Der Elektronenstrahl tastet die Oberfläche ab, die meist mit einem dünnen Goldfilm beschichtet wird. Dabei regt er Elektronen der Beschichtung an und diese sekundären Elektronen werden aufgefangen, und auf einem Sichtschirm geleitet, wo sie die Oberflächenstruktur des Objekts abbilden. Eine wichtige Eigenschaft des REM ist seine große Tiefenschärfe , die ein räumliches Bild möglich macht.

*// Quelle: Rasterelektronenmikrskop bei Wikimedia commons. (http://commons.wikimedia.org/wiki/File: ... -6340F.jpg)
Urheber: Steff (http://commons.wikimedia.org/wiki/User:Steff)
Lizenz: Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 unported (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.en




Vor- und Nachteile der Elektronenmikroskopie

Das Elektronenmikroskop zeigt viele Organellen, die im Lichtmikroskop mit seiner geringen Auflösungsfähigkeit nicht zu erkennen sind. Dafür hat das Lichtmikroskop aber andere Vorteile, insbesondere wenn es um Untersuchungen lebender Zellen geht, wie dies oben schon angedeutet wurde. Dementsprechend sind die chemischen und physikalischen Methoden, mit denen man die Objekte vorbehandeln muss, eine Schwäche des Elektronenmikroskops, da man mit ihnen die Zellen nicht nur abtötet, sondern man erzeugt unter Umständen auch sogenannte Artefakte, künstliche Strukturen, die man dann in den Mikroskopaufnahmen sieht, obwohl sie in der lebenden Zelle nicht vorhanden sind. „Allerdings kommen Artefakte auch in der Lichtmikroskopie vor.“*

*// CAMPELL 2006, S. 132.



Gefrierbruch/Gefrierätzung

In der Biologie diskutierte man schon zum Ende des 19. Jahrhunderts über den Aufbau und die Beschaffenheit von Biomembranen, obgleich man erst in den 1950er Jahren erstmals im Elektronenmikroskop diese sehen konnte. Im Jahr 1972 schlugen Seymour Jonathan Singer und Garth Nicolson ein Membranmodell vor, dass die Membran als ein Mosaik aus Proteinmolekülen, die in einer flüssigen Doppelschicht aus Phospholipiden liegen, darstellt – weshalb dieses Modell auch als Flüssig-Mosaik-Modell bezeichnet wird. Überzeugende Belege, dass die Proteine tatsächlich in die Phospholipid-Doppelschicht eingelagert sind und nicht deren Oberfläche bedecken, gewann man mit dem elektronenmikroskopischen Präparationsverfahren des Gefrierätzens. Dabei spaltet man die Membran zwischen den beiden Phospholipidschichten. Betrachtet man die Membranhälften im Elektronenmikroskop, erscheint das Innere der Membran wie mit Kieseln besetzt, weil die Proteine in eine gleichmäßige Grundsubstanz eingestreut sind.


Die Probe wird bei der Temperatur flüssigen Stickstoffs eingefroren. Bricht man die Zellen anschließend mit einem kalten Messer auf, werden die gefrorenen Zellen nicht glatt gespalten, sondern der Bruch entsteht in der Ebene des geringsten Widerstandes. Die Bruchebene befindet sich häufig im hydrophoben Inneren der Membran, sodass die Doppelschicht in eine innere P-Fläche (plasmatische Fläche) und eine äußere E-Fläche (externe Fläche) gespalten wird. Die Membranproteine werden nicht zerteilt, sondern verbleiben in einer der beiden Phospholipidschichten. Die räumlichen Verhältnisse an der Bruchfläche kann man durch Ätzen – Entfernen des gefrorenen Wassers durch Sublimation – deutlicher hervortreten lassen. Man sprüht einen feinen Paltinnebel schräg auf die gebrochene Zelloberfläche. Wo erhöhte Strukturen den Platindampf abhalten, entstehen ‚Schatten‘. Den Platinüberzug verstärkt man durch Aufbringen eines Kohlefilms. Das Ausgangsmaterial wird mit Bleichlauge, Säure und Enzymen entfernt, sodass der Platin-Kohlefilm als Abdruck der Bruchfläche zurückbleibt. Diesen Abdruck und nicht die Membran selbst untersucht man im Elektronenmikroskop. In die [Abbildung 8.] einer abgeschälten Membran sind elektronenmikroskopische Aufnahmen eingeblendet. Die Proteinmoleküle sind als ‚Höcker‘ zu erkennen.“*

*// CAMPELL 2006, S. 166 .



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Quellen:


CAMPELL, Neil A. / REECE, Jane B. / MARKL, Jürgen (Hrsg.): Biologie, 6. Aufl.,
München 2006.

ROTTMANN, Oswald / HÖFER, Paul: Lexikon Biologie. Fachbegriffe der Biologie, Freising
2002.

UDE, Joachim / KOCH, Michael: Die Zelle. Atlas der Ultrastruktur, Stuttgart 1982.

YEAGLE, Philip: The membranes of cells, San Diego 1987.


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